徠卡顯微鏡的電子光學(xué)系統(tǒng)

 

徠卡生物顯微鏡相當(dāng)于掃描電子顯微鏡的電子光學(xué)系統(tǒng)‘所不同之處是：L出射的電子束束流強(qiáng)度要大，而且要穩(wěn)定。電子束直徑一般為iP、不能因縮小電子轟擊區(qū)而過分縮小電子束直徑，因?yàn)槭鲝?qiáng)度與京的半徑8／3次方成正比。2．發(fā)射電子之間能量的離散要小。因此往往采用熱電子發(fā)射的三極電子槍。3物鏡的中心不能太小。因?yàn)閄射線以大角度射出，為了提高譜儀效率也必須大角度收集。因此物鏡線圈所占空間要大為縮小。辦法之一是用小線圈透鏡，通強(qiáng)電流。但電流強(qiáng)產(chǎn)熱多，就必須用冷阱冷卻物鏡。

 

徠卡生物顯微鏡生物醫(yī)學(xué)標(biāo)本常用冰凍超薄切片。由于x射線收集時(shí)間長(zhǎng)達(dá)幾十秒甚至100秒。束流強(qiáng)度很大的電子束在這樣長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)轟擊標(biāo)本會(huì)把標(biāo)本燒毀，因此必須注入液氮，使標(biāo)本溫度在一800c以下。諾儀可對(duì)待征x射線進(jìn)行波長(zhǎng)及能量分析。進(jìn)行波長(zhǎng)分析時(shí)的被語儀主要是合適的分光晶體，在一定角度使x射線產(chǎn)生衍射。目前多用的是對(duì)特征x射線進(jìn)行能量分析的能譜儀。電鏡室常用的是51（u）x射線能諾儀。它的探測(cè)器是si（H）二極管理漂移硅型）。這種半導(dǎo)體探測(cè)器可以看作一種“固體電離室”。當(dāng)x射線進(jìn)入探測(cè)器后，在半導(dǎo)體的靈敏區(qū)內(nèi)損耗能量產(chǎn)生電子一空穴時(shí)，將它們收集后可形成電脈沖記錄下來*由于si（Li）半導(dǎo)體的靈敏區(qū)大，所以探測(cè)效率高。又由于產(chǎn)生一個(gè)電子一空穴時(shí)所需的平均能量很低，所以這種探測(cè)器靈敏度和統(tǒng)計(jì)特性都比較好。s1（Li）能譜儀的分析速度快，可以同時(shí)分析和確定樣品中含有的原子序數(shù)z＞11的所有元素。雖然該類能諾儀的缺點(diǎn)是能量分析率低，約150ev（波譜儀約5ev），但由于快速分析及效率高等突出優(yōu)點(diǎn)，目前已成為掃描電鏡和透射電鏡上的主要附件。能譜儀都與計(jì)算機(jī)連用。熒光屏上不但顯示特征x射線譜，而且計(jì)算機(jī)技能量分布依次給出元素名稱及濃度。

 

徠卡顯微鏡的標(biāo)本制備方法

 

徠卡生物顯微鏡70年代在探針技術(shù)上有兩大進(jìn)展，*是將透射電鏡與x微區(qū)分析結(jié)合*第二是固態(tài)能量色散x一線探測(cè)器的應(yīng)用。這便使得操作人員可將一細(xì)電子束準(zhǔn)確地置于某細(xì)胞器內(nèi)，使探針電流控制在幾個(gè)nA范圍內(nèi)，減少了對(duì)標(biāo)本的損傷，提高了像的質(zhì)量。為此，對(duì)標(biāo)本的制備提出了更高的要求。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室不約而同地在探索如何在保存超微結(jié)構(gòu)的同時(shí)也保存元素成分在原位而不移動(dòng)或丟失。HaH實(shí)驗(yàn)室的工作人員研究肌細(xì)胞線粒體對(duì)鋇的攝取，他們發(fā)現(xiàn)用醋酸鈾染色后線粒體中只有鈾而無鋇，只有在不經(jīng)染色的標(biāo)本中線粒體內(nèi)才有鋇。他們?cè)谘芯侩u胚紅細(xì)胞核中的鈉和其它電解質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)胞核內(nèi)鈉濃度幾乎與胞外介質(zhì)無差別。但他們對(duì)標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片和冰凍干燥處理后，發(fā)現(xiàn)上述結(jié)果是錯(cuò)誤的。因此Hall等認(rèn)為標(biāo)本制備的*方法是將組織立即冰凍（即粹冷固定）．然后用徠卡冰凍切片機(jī)做冰陳超薄切片。或?qū)Ρ鶅龀∏衅苯佑^察分析，或?qū)⑵浔鶅龈稍锖笤儆^察。他特別提出在分析組織的細(xì)胞外空間成分時(shí)，用未經(jīng)干燥的冰凍超薄切片直接分析。

 

徠卡生物顯微鏡由于組織未經(jīng)四氧化鑰固定和染色，在經(jīng)過冰涼固定后結(jié)構(gòu)雖得以保存．但反差相當(dāng)差。人們又想到是否可用低溫置換固定或組織經(jīng)冰凍干燥后再包埋、切片及染色以提高反差，增進(jìn)像的質(zhì)量。R加s實(shí)驗(yàn)室在此方面做了較深入的工作。他們以大鼠胰腺外分泌細(xì)胞不同部位的電解質(zhì)分布為觀測(cè)對(duì)象，比較幾種標(biāo)本處理方法的優(yōu)劣。首先對(duì)大鼠做主動(dòng)脈灌注，然后對(duì)胰腺作原位冰凍固定．或移出后做冰凍固定。他們對(duì)冰凍固定后的胰腺用自制的裝置做以下幾種處理；1．作多聚甲醛和四氧化俄低溫置換固定及樹脂包埋（Fs）；2．低溫干燥后進(jìn)行樹脂包埋（四）和L冰凍超薄切片后進(jìn)行冰涼干燥（cs）。然后分別對(duì)細(xì)胞的頂部胞漿、基部腦漿、酶元顆粒及錢糧體中的Ha、M8、P、s、酗、K及Ca做定量測(cè)定（刪1／k8drywt）。其結(jié)果如表lo一1所示。由表可見，幾種方法的結(jié)果十分不同。低溫置換固定后包埋使電解質(zhì)丟失zui多。即使低溫干燥后做樹脂包埋也有明顯丟失，特別在頂部及基部胞漿中磷和鉀丟失zui多。RoM等認(rèn)為是由于使用了高度疏水的sPun和Epn樹脂包埋時(shí)，使磷脂提取，質(zhì)膜損傷后胞內(nèi)可移動(dòng)的鉀及其它成分漏出所致。因此，RM的結(jié)論是對(duì)于研究元素在細(xì)胞內(nèi)不同部位及細(xì)胞器中的分布而言，組織冰凍固定、冰凍超薄切片及隨后的冰凍干燥是的方法。

 

備注:徠卡顯微鏡儀器結(jié)構(gòu)特點(diǎn)部分文章由北京中儀光科科技發(fā)展有限公司編輯上傳。