免疫熒光(IF)是一種用于可視化觀察細胞內過程、狀態和結構的強大工具。 IF制劑可通過多種顯微鏡技術（如激光共聚焦、寬場熒光、全內反射成像、基態淬滅顯微成像等）來加以分析，具體取決于應用目的或研究人員的關注重點。 與此同時，在很多使用至少一套簡易熒光顯微鏡的研究工作組當中，IF早已成為重要的一部分。
IF實驗的核心部分是兩種不同組分的組合：
◇ 首先是特異性抗體，用于形成免疫復合物來標記細胞內需要研究的分子，大多數情況下為蛋白質。
◇ 其次是熒光色素，與免疫復合物耦合，因此可以用顯微鏡觀察目標結構。
圖 1： 圖中顯示了間接免疫熒光的典型工作流程，上皮細胞粘附在蓋玻片上生長。 培養后細胞被固定，因此用化學交聯劑（如甲醛）將其殺死。 再用清潔劑進行透化處理，使抗體穿過細胞膜。 用正常血清、奶粉或牛血清白蛋白來進行封閉，可減少抗體與非靶向結構的非特異性結合，從而減少假陽性信號。 接下來與一抗進行孵育，特異性識別靶向分子上的表位。 在第二個培育步驟中，應用熒光耦合二抗，與一抗結合來實現靶向結構的可視化觀察。 抗體孵育后，用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料進行細胞核染色。 使用封固介質（例如Mowiol或Prolong Gold）將蓋玻片封固在載玻片上后，IF即已準備好進行顯微鏡觀察。
直接與間接免疫熒光
根據實驗類型的不同，有兩種不同的IF變體可以使用： 第一種是直接IF或一級IF，一種具有特異性的一抗，能夠與熒光色素連接，用于結合靶向結構并實現直接可視化觀察。
第二種變體是間接或二級IF，這種變體需要采用兩步式培育。 首先，特異性一抗識別靶向結構。 然后應用與一抗特異結合的熒光色素耦合二抗。
這種特異性是通過引導二抗抵御產生一抗的物種而獲得的（見抗體和熒光色素章節）。 比較兩種IF變體可見兩者各有不同的優缺點：
通過耦合一抗和熒光色素，耗時的清洗和培育步驟被省略，所以直接IF比間接IF更快。 因此，直接IF更易于處理，適合于在標準IF實驗中（例如在臨床實踐中）對樣本進行快速分析。 但必須使用一種功能良好且對其抗原高度敏感的一抗。 這同時也是一個缺點，因為熒光耦合和驗證的一抗成本較為高昂。 此外，每個靶向結構都需要一個單獨的一抗，與間接IF相比，抗體與直接IF中的熒光色素的連接會限制實驗設計的靈活性。
這種靈活性是間接IF的顯著優勢之一。 通常在IF反應過程中，同一樣本都會有幾個不同的靶結構需要實現可視化觀察，因此必須為每個靶向分子選擇一個離散的熒光色素。 在間接IF中，不同的熒光耦合二抗可以與不同的一抗結合（當然還要考慮到物種的反應性）。 相較之下，如果想在直接IF中對靶向結構“玩"顏色組合，則需要為每一種顏色使用單獨的一抗。 間接熒光的另一個優點是二抗的信號放大。 多個二抗分子可與一個一抗結合來實現熒光增強，這意味可減少使用一抗。
間接IF的工作流程可能需要花費更多時間，但由于一抗和二抗能夠組合而且整個操作過程的經濟性更高，因此間接熒光成為了絕大多數研究人員的方法。
有兩種方法通過免疫熒光顯示靶向結構： 在兩種變體中，一種特異的一抗用于識別靶分子上的特定表位。
圖 2： 有兩種方法通過免疫熒光顯示靶向結構： 在兩種變體中，一種特異的一抗用于識別靶分子上的特定表位。 在此圖中，靶分子由幾個相同的蛋白質亞單位（=大分子）組成，因此會在每個亞單位上表現出幾個相同類型的表位。 為方便簡化，此處只描繪了一個表位。
直接IF中，一抗直接連接到熒光色素，在顯微鏡下觀察靶向結構。
間接IF中，熒光耦合二抗在第二培育步驟中使用，從而專門對一抗進行標記。 因為多個二抗分子可以結合到一個一抗上，所以選擇抗體和熒光色素的靈活性更大，并能夠進一步放大信號。
抗體和熒光色素
高質量的IF染色當中，最重要的工具是良好的一抗。 同時，幾乎每種細胞類型中的每種蛋白質都有一種或幾種市售抗體。 但此處需要強調若干重要注意事項。
要根據IF染色來做出精確的科學或臨床聲明，就必須確保一抗對其目標抗原的特異性。 在操作中，研究人員不應依賴商業供應商的說明。 應根據之前的使用經驗以及文獻中確認有效的一抗來進行抗體選擇。 查看制造商網站上的抗體數據表，查看IF染色的可用圖片并與自身期望相比較，或者與其他已發布的插圖進行比較。 注意抗體的克隆性，因為單克隆抗體只與一個表位特異性結合，而多克隆抗體可識別多個表位，因此更有可能存在非靶向結構的非特異性標記。 所以，特異性較高且性能較優的單克隆抗體通常更昂貴，但也能獲得更好的效果。
如希望開展多色間接IF實驗，則不同的一抗必須衍生自不同的物種，以便在之后通過熒光耦合二抗來區分免疫復合體（見表1）。 比如，您希望使用小鼠衍生的抗體抗蛋白A、兔衍生的抗體抗蛋白B和大鼠衍生的抗體抗蛋白C來實施IF檢查。 在選擇二抗時必須記住，每種抗體都只能特定識別一種一抗。 此外，在這三種二抗的例子中，熒光色素的波長光譜必須不同，以便在顯微鏡分析中辨別熒光信號。 如今，可以買到與熒光色素相連的二抗，其波長范圍從紫外線到紅外線，幾乎可以針對任何物種的一抗。 因此，研究人員目前僅受到現有顯微鏡（濾光片組、激發激光器）配置的限制。
表 1：此處的多色間接IF示例演示了如何在同一個細胞中同時標記三種不同的蛋白質。
三種蛋白質的一抗必須來自不同的物種，以便用三種不同的熒光色素耦合二抗來進行檢測。 二抗的熒光色素必須在波長光譜上有所區分才能在顯微鏡下進行不同的分析。 對示例圖像中描繪的細胞還使用Hoechst 33342進行處理，完成了細胞核染色。 在Leica TCS SP2上進行顯微鏡檢查。
樣本
IF方案存在于多種不同的樣本當中。 簡單常用的方法是對細胞培養物中的培養（真核）細胞進行染色。 貼壁生長的細胞可以接種在蓋玻片上，采用多微孔插入或者直接接種在玻璃底培養皿上并在所需的時間用于IF檢查。 IF還可在細胞涂抹于載玻片（例如細胞離心涂片）后用于懸浮細胞的檢查。 在這兩種情況下，需重點分析細胞內的過程或結構，這被稱為免疫細胞化學(ICC)。
另一方面，在免疫組織化學
(IHC)typo3/中，通過組織特定的環境聯系來檢查是否存在蛋白質或分子。 此處器官制備的超薄切片（通常包埋在石蠟中）用于比較研究健康器官與疾病器官中蛋白質的表達。 除了制備組織切片外，還可以對整個生物體進行IF檢查，這一過程被稱為“整體IHC"。 為此可使用不同模式生物的胚胎如小鼠、雞或斑馬魚等，或植物模式生物如擬南芥。 在整體IHC中會受到樣本尺寸和相關IF試劑透化深度的限制。 單獨的孵育步驟比培養細胞的染色要長。 此外還必須提供帶有特殊光學設備的顯微鏡用于大樣本分析。
圖3：a) 人類腎臟的免疫組織化學(IHC)染色在不同的結構中顯示了不同的細胞類型（如腎小球、近曲小管、遠曲小管）。
綠色熒光色素標記蛋白的表達僅限于特定的細胞類型，而紅色標記蛋白則廣泛表達。 b) 免疫細胞化學(ICC)圖像顯示間接免疫熒光對同一類型細胞(MDCK)中的兩種蛋白質的染色情況。
此處無法開展組織特異性研究，但是如果兩種蛋白質在同一個結構中共定位則可以進行分析。 對兩個樣本使用Hoechst 33342進行處理，完成了細胞核染色。 在Leica TCS SP2上進行顯微鏡檢查。
清洗步驟
在IF程序中應特別注意清洗步驟，因為適當的清洗可以提高IF質量。 PBS是一種標準的清洗緩沖液，而PBS++或PBS-T等變體也很普遍。 PBS++含有1 mM CaCl2和MgCl2，推測其具有防止細胞分離的膜穩定作用。 對于PBS-T，添加最終濃度為0.05%的清潔劑Tween 20，目的是增加抗體的結合特異性。 請務必注意小心地涂抹并吸取清洗緩沖液以免細胞從培養容器或蓋玻片上脫落。
如有足夠的時間，請在吸取緩沖液時等待幾分鐘，以確保清洗緩沖液有效擴散到樣本中。 IF程序的各個清洗步驟在下面的標準方案中列出。
傳統IF反應的各步驟描述如下。 本文結尾附有常用的間接IF與培養細胞的標準程序。
固定
固定是IF程序的第一步。
其目的是保持細胞、細胞結構或組織處于其當前狀態，并通過化學試劑長期保存。 在固定過程中，重要的是細胞結構盡可能保持其原有的構象。 不同的固定方法對IF有用，每種試劑對一抗表位有不同的影響。 抗體結合位點可能被掩蓋或被固定所破壞，這會損害IF染色質量。 由于每種抗體以不同的方式與抗原結合依賴于不同的固定化合物，因此有必要嘗試新抗體的幾種固定方法。
通常，合適的固定劑規格可以在抗體的數據表上找到。 理想的固定應能夠保存細胞和亞細胞結構，并為良好的抗體結合暴露出抗原。 實際上，您必須在兩者之間取得平衡。
固定試劑可以大致劃分成2組：化學交聯劑和有機溶劑。
化學交聯劑如通過游離氨基形成的福爾馬林交聯蛋白；細胞形態在大多數情況下保存良好。 但抗原也可能發生交聯，進而可能減少抗體結合。 戊二醛對細胞結構也有保存固定作用，但會導致顯微鏡下觀察到樣本有很強的自發熒光（見對照章節）。
有機溶劑如甲醇或丙酮等具有脫氫作用并沉淀蛋白質，從而將其固定在細胞環境中。 但切記，在該過程中可溶性分子和許多脂質成分都會丟失。
通常將甲醇和丙酮組合使用，因為盡管甲醇適合保存細胞結構，但它對許多表位有極其不利的影響， 而丙酮卻破壞性較小。 除此還應該考慮到，已存在于細胞中的熒光蛋白（如GFP）會因被有機溶劑固定而在很大程度上被破壞。 如果一抗的制造商未建議使用何種固定劑，則用4%福爾馬林在室溫下處理10分鐘即可用于各種細胞系和抗原。
表 2： 固定試劑。
透化
通過透化處理，抗體可以進入細胞內結構，否則抗體就無法通過細胞的脂膜。 根據固定類型，有時需要單獨的透化處理。 用有機溶劑固定時，細胞膜已經具有滲透性，您可以直接進入封閉步驟。 用化學交聯劑固定的細胞需要用清潔劑進行額外處理以實現透化。 使用Triton X-100或NP-40等傳統清潔劑，但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黃皂甙。 同樣，根據應用的物質、濃度和培養時間會得到不同的結果，因此實驗人員應該在開始時嘗試不同的參數。 典型的步驟是在室溫下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分鐘。
如果希望通過IF來分析脂質相關蛋白或膜蛋白，則應謹慎開展透化步驟（=脂質去除）。 比較理想的選擇是皂甙，能選擇性去除質膜上的膽固醇，使細胞內的膜基本上完好無損。 如果在抗體染色前忽略了透化處理（只能通過化學交聯劑固定），則可以專門標記細胞外質膜結合抗原，以便將其與胞內抗原分開來。 核酸染料如DAPI或Hoechst（見細胞核染色和樣本封固章節）具有膜滲透性，因此不需要透化處理。
封閉
封閉是在細胞內最大限度降低一抗非特異性結合的重要步驟。 為了實現這一點，可以使用來自牛血清白蛋白(BSA)、奶粉或血清中的蛋白質。 關鍵在于，這些封閉蛋白質并不源于產生一抗的物種，否則二抗對于一抗的特異性就會損失。 如果您使用的是二抗，如山羊產生的抗小鼠一抗，則理想的封閉試劑是正常的山羊血清。 通常使用濃度為1%（奶粉，BSA）至5%（正常血清）的封閉溶液，并在清洗緩沖液中稀釋。 在室溫下孵育30-60分鐘。
免疫反應
經固定、透化和封閉步驟制備樣本后，會開始進行免疫反應。 樣本現在與特定的一抗一起孵育，以標記所需的靶結構。 幾種一抗可同時應用于樣本。 如上所述，在間接多色IF中，幾種一抗必須來源于不同的物種。 首先根據制造商的要求，在選定的封閉溶液中進行抗體稀釋。 如果對染色不滿意，或者如果制造商沒有提供任何關于有效稀釋的信息，您應該嘗試使濃度保持在1:50到1:1000之間。 根據抗體的親和力，孵育時間可能會有所不同。 默認培育時間為室溫下1-2小時；也可以在4℃下過夜。
如果選擇直接IF，則可在一抗孵育后直接進行封片，因為一抗已經帶有熒光色素。 在間接IF當中，二抗現在已經對一抗進行了熒光標記。 這里的關鍵點在于使用一抗孵育后要充分清洗，以減少二抗的非特異性結合。 二抗也可以在封閉溶液或清洗緩沖液中進行稀釋。 如果制造商沒有不同的指示，可以從1:200的稀釋開始，在室溫下孵育1小時。 有必要避光培養以防出現熒光色素漂白。
細胞核染色與樣本封片
免疫反應之后通常是用DNA染料對細胞核染色。 另一方面，在用顯微鏡觀察時這種處理可以更好地在細胞或組織切片內進行定向，同時還可以指示出細胞狀態（如有絲分裂）是否為研究所需的狀態。 即便在沒有透化的情況下也能進入到細胞核并插入DNA中的染料，如Hoechst或DAPI等，可以用于此目的。 有鑒于此，實驗人員應當十分小心，避免這些染料直接與皮膚接觸！ 室溫下簡單的細胞核染色耗時大約10分鐘，期間Hoechst或DAPI需在PBS中稀釋。
完成IF步驟后，樣本必須適當封片以便于開展顯微鏡檢查。 有鑒于此，需要使用封固介質（如Mowiol或Prolong Gold）將樣本固定在顯微鏡載玻片上并防止樣本脫水。 另外，封固介質增加了折射率，有利于使用油浸物鏡進行顯微鏡檢查。 一些制造商提供了帶有添加劑的封固介質，如DABCO，這是一種防止樣本光漂白的防褪色劑。 根據使用的熒光色素，一些抗褪色劑比其他的更有效。 此外，還可使用添加了DNA染料的封固介質以便在包埋期間對細胞核進行染色，就無需進行單獨的細胞核染色。 如果使用硬化封固介質（通常情況下），則允許樣本過夜固化，因此可以在第二天進行顯微鏡檢查。 以這種方式生產的玻片幾乎可以長時間儲存在室溫或4℃的黑暗環境中，但請記住，熒光色素的熒光強度會隨著時間的推移而減弱。
圖 4： 貼壁生長的上皮細胞（MDCK）在蓋玻片上培養、固定，細胞核用Hoechst 33342染色。 大多數細胞表現出間期DNA染色，但一些細胞出現染色體濃縮，這些染色體在有絲分裂中分離（星號）。 在徠卡TCS SP2上進行顯微鏡檢查。
圖 5： 該圖展示了成纖維細胞（COS-7）當中細胞微管網狀結構的間接IF染色。 細胞核使用Hoechst 33342進行染色并在Leica TCS SP2上開展顯微鏡檢查。
對照
免疫熒光必須進行適當對照，以正確顯示顯微鏡圖像。 缺少或不適合的對照通常會導致假陽性結論和不正確的數據。 首先應當分析只被固定、透化和封閉的樣本以便了解細胞間室的自發熒光typo3/。 有時即使沒有進行IF染色，結構也可能出現強熒光信號。
為了進一步的對照和調整間接IF的顯微鏡參數，使用已采用上述方法進行處理過的樣本，但樣本還要額外使用二抗進行孵育。 首先將揭示二抗與樣本的強非特異性結合。 其次，設置顯微鏡參數以便在該對照的圖像采集期間不記錄任何信號。 此設置用作后續采集的閾值來排除二抗的假陽性信號。 在直接IF當中，自體熒光對照用于調節閾值。 接下來分析與特異性一抗一起孵育的樣本，如果是間接IF，也分析與二抗一起孵育的樣本。 此時應可檢測到熒光信號，其高于自發熒光和二抗的陰性對照。
為了確保一抗特異性標記所需結構，一些制造商為一抗提供可遮蔽特定抗原的肽封閉，從而防止抗體與其表位結合。 如此處理成本高昂，但也是確定抗體特異性的最佳方法，因此得到可靠的結果。 在多色IF實驗中還必須注意所選熒光色素之間的串擾。 如果是第一次進行多色IF檢查，建議在單獨的制備中另外染色靶向結構，并將這些圖像與多色圖像進行比較。 最后應該仔細查看所獲得的數據并將其與您的期望和一抗的現有數據進行比較。
表 3： 哪些對照測試哪些內容？
局限性
如前所述，IF檢查有諸多優勢，但同樣也存在著一定的劣勢。 關鍵點是樣本的固定： 固定意味著滅活，因此活細胞成像已變得不再可能。 因此對動態過程的分析會比較復雜，每個時間點上的細胞都必須予以固定和染色。 所以快速動態過程無法通過IF來進行觀察。 這顯然是融合蛋白表達熒光標記如GFP（綠色熒光蛋白）的優勢，比較適合用于活細胞成像。 如上所述，IF實驗過程中（固定/透化）會改變細胞結構，因此偽影可解釋為假陽性信號。 所以有必要為每個IF染色準備適當的對照品，可能很費時。 另一個缺點同樣不可避免：熒光染料的光漂白。 像GFP這樣的熒光蛋白也受此影響，但當儲存在適當的條件下，即使在幾個月的長期制備后，GFP也能被檢測到。 相反，IF熒光色素的強度損失更快，這反映在顯微鏡下樣本的快速漂白。 即使是用抗褪色劑封固介質也只能暫時起作用。
圖 6： 整套程序的流程圖。
標準IF流程
IF實驗所需時間：約5個小時。
這是一種蓋玻片上通過化學交聯劑進行固定的培育細胞接受間接IF檢查的標準方案。
◇ 濕盒非常適合IF實驗，并且可以輕松完成自制（見幻燈片“如何制備濕盒"）。 該處理可防止試劑干燥并允許在黑暗中進行培養，這對于處理熒光色素很重要，并且對于已經存在的熒光蛋白是必要的。
◇ 試劑用量的選擇要確保蓋玻片能夠濕潤。 確保樣本絕對不會太干燥。
◇ 所有培育步驟都在室溫下完成。
※ 清洗細胞兩次并使用鑷子小心地將帶有向上翻轉細胞的蓋玻片放入濕盒。
※ 使用4%福爾馬林進行10分鐘的固定并清洗3次。
※ 使用0.1% TX-100/PBS進行15-20分鐘的透化處理并清洗3次。
※ 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS進行45分鐘的封閉（無需清洗）。
※ 在封閉溶液內稀釋一抗并使用2小時（或在4℃下連夜使用）。 清洗4次將未結合的一抗清除掉。
※ 使用二抗進行1個小時的孵育，在封閉溶液或清洗緩沖液內進行稀釋。
※ 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS中孵育10分鐘。 清洗4次，即便此時還沒有出現細胞核染色。
※ 用鑷子輕輕取出蓋玻片并將其浸入dH2O 內，清除掉清洗緩沖液的殘留鹽分。
※ 在顯微鏡載玻片上滴一滴封固溶液并將蓋玻片與細胞倒置這滴溶液上。 用鑷子輕輕按壓樣本，使封固介質均勻分布而不會擠壓樣本。
※ 固化后就準備好進行顯微鏡觀察了。
配方
◇ 清洗緩沖液
※ 1 × PBS（磷酸鹽生理鹽水緩沖液）
※ 137 mM：NaCI
※ 2.7 mM：KCI
※ 10mM：Na2HPO4
※ 1.8 mM：KH2PO4
◇ 使用HCI將pH值調節到7.2-7.4
◇ 為PBS++，需添加最終濃度為1 mM的 CaCl2和MgCl2
◇ 如為PBS-T，需添加最終濃度為0.05%的Tween 20
固定緩沖液
◇ 福爾馬林：
※ 將4% PFA（多聚甲醛）溶解于溫暖（50-70℃）的dH2O中，pH值8（使用NaOH進行調節）。
※ 將10 × PBS添加到最終濃度為1 × PBS的溶液中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
※ 使用HCI將pH值調節到7.2-7.4。
◇ 甲醇（預先冷凍至-20℃）：
※ 100%甲醇（-20℃）
◇ 甲醇/丙酮（預先冷凍至 -20℃）：
※ 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）
透化緩沖液
◇ TX-100（Triton X-100)：
※ PBS，最終濃度0.1% TX-100
◇ 皂苷：
※ PBS，最終濃度0.1%的皂甙
◇ 其他清潔劑可在PBS中以相同濃度使用。
封閉緩沖液
◇ BSA（牛血清白蛋白）：
※ PBS，最終濃度為1% BSA
◇ 奶粉：
※ PBS，最終濃度為1%奶粉
◇ 正常血清：
※ PBS，最終濃度為5%正常血清
細胞核染料
◇ Hoechst或DAPI：
※ 在PBS中制備Hoechst 33342或DAPI溶液，最終工作濃度為1 μg/mL。
